蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈通過氫鍵連接盤旋而形成的結(jié)構(gòu),包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu),其中前兩者為規(guī)則有序結(jié)構(gòu),后兩者相較于前兩者表現(xiàn)得更加無(wú)序。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到外界條件影響時(shí),蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定程度的改變,從而導(dǎo)致其功能特性發(fā)生變化,如凝膠性、持水能力、溶解性、乳化性和流變性等,因此研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,有助于預(yù)測(cè)蛋白的功能特性,進(jìn)而了解原料的加工特性。

目前國(guó)內(nèi)外研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有傅里葉紅外光譜法、拉曼光譜法、X-射線衍射法、圓二色譜法以及核磁共振法,其中傅里葉紅外光譜法和拉曼光譜法是*常用的方法。

傅里葉紅外光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法及優(yōu)缺點(diǎn)

傅里葉紅外光譜法可檢測(cè)不同狀態(tài)的蛋白樣品,包括固體樣品和液體樣品,但因水在1640cm-1附近的吸收會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生強(qiáng)大干擾,因此通常情況下固體樣品更多被選擇。固體樣品制備方法有很多,*常用的是KBr壓片法。樣品薄片制備后,置于紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定,常用的測(cè)定參數(shù)為:掃描范圍400~4000cm-1,以KBr空白片做參比,分辨率設(shè)置為4cm-1,掃描次數(shù)為128次,得出圖譜。將圖譜在傅里葉紅外光譜儀中進(jìn)行初步處理,用OPUS軟件進(jìn)行基線校正、去卷積以及二階導(dǎo)數(shù)擬合(直至R2不變?yōu)橹?,確定各個(gè)子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系,根據(jù)各子峰面積百分比計(jì)算各部分二級(jí)結(jié)構(gòu)含量,每組樣品平行測(cè)定多次,取平均值。

傅里葉紅外光譜法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、分辨率好、掃描速度快、信噪比高、能檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)微小變化等特點(diǎn)。有如下優(yōu)勢(shì):

(1)不受官能團(tuán)、相對(duì)分子質(zhì)量等條件限制,測(cè)定樣品量少,對(duì)樣品沒有特殊要求,可以對(duì)水溶液、晶體和固體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行構(gòu)象分析,可鑒定多種成分。

(2)傅里葉紅外光譜法應(yīng)用范圍廣,不但能夠直接進(jìn)行檢測(cè)分析,還可以跟其他色譜、質(zhì)譜儀聯(lián)用,極大提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。

(3)不受其他物質(zhì)干擾,可從復(fù)雜的物質(zhì)體系中快速識(shí)別目標(biāo)物質(zhì),且無(wú)需重復(fù)檢測(cè),檢測(cè)重現(xiàn)性好。

但由于整個(gè)系統(tǒng)設(shè)備體積大、價(jià)格高、測(cè)量氣體樣品時(shí)易受其他氣體干擾,使用壓片法測(cè)量時(shí)制得的樣品易碎且必須嚴(yán)格干燥,增加了操作的復(fù)雜性。

拉曼光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法及優(yōu)缺點(diǎn)

采用拉曼光譜法檢測(cè)蛋白樣品時(shí),與傅里葉紅外光譜法不同,蛋白提純后可直接置于拉曼光譜儀中進(jìn)行測(cè)定,常用的測(cè)定參數(shù)設(shè)定為:掃描波長(zhǎng)為785nm,激光功率為300mW,掃描范圍:400~4000cm-1,掃描時(shí)間每次60s,4次掃描進(jìn)行累加,以苯丙氨酸[(1003±1)cm-1]作為歸一化因子,并用顯微鏡進(jìn)行觀察,將光譜用Origin8.5進(jìn)行平滑處理,采用OPUS軟件進(jìn)行擬合分析并通過峰面積比得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

拉曼光譜法具有靈敏度高,樣品量少(μg級(jí)),分析速度快、操作簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn),可進(jìn)行無(wú)損分析,試樣可直接通過光纖探頭進(jìn)行測(cè)量。有如下優(yōu)勢(shì):

(1)此方法對(duì)樣品狀態(tài)不設(shè)限制,可檢測(cè)固、液、氣多種狀態(tài)樣品物質(zhì)。

(2)拉曼光譜法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,樣品可在其本征狀態(tài)下直接進(jìn)行測(cè)試,避免了對(duì)樣品的破壞及檢測(cè)過程中人為導(dǎo)致的誤差。

(3)由于水的拉曼散射很弱,因此拉曼光譜法非常適合研究水體系,且在進(jìn)**體檢測(cè)時(shí),無(wú)需分離樣品氣體,可同時(shí)檢測(cè)多組分氣體樣品,**節(jié)約了時(shí)間成本。

傅里葉紅外光譜法和拉曼光譜法已成為表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)強(qiáng)有力的工具,通過對(duì)圖譜的處理分析,可獲取蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。但這2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn),傅里葉紅外光譜法更適合干燥易磨粉的樣品,拉曼光譜法則對(duì)樣品狀態(tài)沒有限制。